細胞培養(yǎng)被支原體污染是個世界性問題，在細胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達到63%。支原體是一類無細胞壁，形態(tài)呈高度多形性，為圓形、絲狀或梨形，其直徑僅有0.13～0.18μm，變形能力大，故能通過濾菌器，突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細胞壁，對作用于細胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明，支原體能耗盡營養(yǎng)物，促進代謝積累，導(dǎo)致pH改變，對細胞造成多種影響，包括生長狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細胞存活等多方面的改變，繼而干擾實驗結(jié)果，或造成無法解釋的差異。更加不幸的是拯救被感染的細胞幾乎是不可能的。下面介紹了幾種檢測方式，或許對你的實驗有用。
1、分離培養(yǎng)法
分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標方法，其檢測精確度最高。這種方法是從可疑的細胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽為支原體檢測金標準。
但是，分離培養(yǎng)法也存在兩個弊端，一是檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候，例如支原體M. hyorhinis。
2、DNA檢測法，也稱直接培養(yǎng)法
將可疑樣品與指示細胞共同培養(yǎng)，一般需要幾天時間。DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細胞，如果原樣本中含有支原體，那么當細胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時，就可以在指示細胞的核周圍觀察到熒光斑點或熒光顆粒。
但是這種方法靈敏度太低，當檢測成陽性時，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染。且Hoechst熒光染色：操作復(fù)雜，操作不當易造成假陽性或假陰性。
3、PCR法
市面上有許多商機提供基于PCR的支原體檢測試劑盒，如GeneCopoeia。這種方法已經(jīng)比較成熟，應(yīng)用的范圍也較為廣泛。
PCR法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其PCR引物可特異擴增支原體基因組中rDNA保守序列，包括所有已知的支原體，及細胞培養(yǎng)過程普遍遇到的種屬，例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。
PCR法快速，簡便，具有強擴增能力和高的敏感性，可以檢測大多數(shù)支原體，但謹慎起見最好同時使用另一種檢測方法來進行驗證。PCR法檢測支原體只需幾個小時，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法。
4、酶學檢測
酶學檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。
最后，建議你進行定期檢測。
支原體感染會影響細胞的正常生長，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應(yīng)該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去，是細胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。
通常來說，被污染的細胞應(yīng)該丟棄，以避免成為污染源。但對于珍貴的細胞，以往別的品牌的支原體清除劑，其實只是抑制劑，它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成，但無法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌，可與支原體膜特異性結(jié)合，破壞膜通透性，導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。
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